导读：

近期，广州医科大学陈文杰教授、You Zhou与云南省消化内镜临床医学中心Jialong Qi等人合作，成功开发了一种基于微流控技术与析因设计优化的脂质纳米颗粒（LNP）疫苗，该疫苗共装载HPV E7抗原肽与镁佐剂，解决了传统铝佐剂疗效有限、不良反应多等问题，在小鼠模型中显著抑制肿瘤生长并诱导强烈的抗原特异性T细胞免疫应答。相关研究以“A factorial design-optimized microfluidic LNP vaccine elicits potent magnesium-adjuvating cancer immunotherapy”为题目，发表在期刊《Materials Today Bio》上。

本文要点：

1、本研究针对HPV相关癌症，开发了一种基于微流控技术和析因设计优化的脂质纳米颗粒（LNP）疫苗，共载E7抗原肽与镁离子佐剂。

2、镁离子替代传统铝佐剂，展现出更强的T细胞活化和细胞免疫应答能力。

3、机制研究表明，镁离子通过胶原-CD36轴促进树突状细胞成熟与抗原呈递，发挥佐剂作用。

4、通过实验设计（DoE）优化，LNP配方在包封率和稳定性上得到提升，有望成为针对HPV相关癌症的靶向免疫激活系统。

5、该研究证实了镁离子作为LNP疫苗佐剂的有效性和安全性，为癌症治疗性疫苗研发提供了新思路。

图 1 微流控优化镁佐剂 LNP 癌症疫苗的研究方案。（I）通过确定性筛选设计（DSD）确定 LNP 制备中的脂质浓度、流率比（FRR）与总流速（TFR）；（II）对脂质类型、缓冲体系及 E7 剂量进行实验设计（DoE）优化；（III）加入 Mg²⁺制备 LNP@E7&Mg 纳米疫苗，用于后续实验；（IV）探究镁离子的佐剂作用机制及 LNP@E7&Mg 疫苗的抗肿瘤免疫治疗效果。

图 2 纳米疫苗的表征、细胞活性及细胞摄取实验。（A）基于微流控技术结合 DoE 优化制备 LNP 与 LNP@E7 的示意图；（B）LNP@E7&Mg 的透射电镜（TEM）代表性图像，插图中标尺为 500 nm；（C）LNP 疫苗颗粒的 zeta 电位分析；（D）LNP@E7&Mg 的动态光散射（DLS）图谱；（E, F）LNP@E7&Mg 与 LNP@E7&Al 的元素映射代表性图像；（G）LNP@E7&Mg 粒径随时间变化的曲线；（H）不同浓度纳米疫苗的溶血实验结果；（I）不同浓度纳米疫苗溶血率的统计分析；（J）不同浓度纳米疫苗安全性的细胞活性实验；（K）共聚焦显微镜观察 DC2.4 细胞孵育 6 h 后对 E7 肽的摄取情况，标尺为 50 μm；（L）流式细胞术检测不同处理组纳米疫苗孵育 DC2.4 细胞 6 h 后的平均荧光强度（MFI）。采用方差分析（ANOVA）检验，*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001 表示组间差异具有统计学意义。

图 3 骨髓来源树突状细胞（BMDCs）的体外活化实验。（A）纳米疫苗处理后 BMDCs 表面 CD80 CD86 细胞群的表达分析及相应统计图；（B）纳米疫苗处理后 BMDCs 表面 CD80 表达的分析及相应统计图；（C）纳米疫苗处理后 BMDCs 表面 CD86 表达的分析及相应统计图；（D）纳米疫苗处理后 BMDCs 分泌干扰素 -β（IFN-β）、干扰素 -γ（IFN-γ）、白细胞介素 - 1β（IL-1β）与肿瘤坏死因子 -α（TNF-α）的水平。采用方差分析（ANOVA）检验，*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001 表示组间差异具有统计学意义。

图 4 转录组测序（RNA-seq）分析 Mg²⁺的佐剂作用机制。（A）LNP@E7&Mg 与 LNP@E7 处理 BMDCs 后的 GO 富集分析气泡图；（B）LNP@E7&Mg 处理组相较于 LNP@E7 处理组 BMDCs 中差异表达基因的前 20 个富集通路；（C）基因调控谱的火山图，其中上调最显著的两个基因（Cd36、Col1a1）用红色标注；（D）基因集富集分析（GSEA）显示 LNP@E7&Mg 与 LNP@E7 处理 BMDCs 中胶原形成通路的富集情况。

图 5 纳米疫苗的抗肿瘤活性实验。（A）小鼠免疫方案，每组 n=5；（B）各组小鼠的体重增长曲线；（C）各组小鼠 21 天内的肿瘤生长曲线；（D）各组小鼠的肿瘤重量；（E）肿瘤实物照片；（F–K）各组单只小鼠肿瘤生长的动态监测曲线。采用方差分析（ANOVA）检验，*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001 表示组间差异具有统计学意义。

图 6 不同纳米疫苗处理后肿瘤组织中免疫细胞的流式细胞术分析。（A）肿瘤组织中 CD8⁺T 细胞含量的流式分析及统计数据；（B）肿瘤组织中细胞毒性 T 淋巴细胞（CTLs，CD8⁺IFNγ⁺）的代表性图像及统计数据；（C）肿瘤组织中髓系抑制细胞（MDSCs，CD11b⁺Gr-1⁺）的流式分析及统计数据；（D）肿瘤浸润调节性 T 细胞（Tregs，CD4⁺Foxp3⁺）的代表性流式图及统计数据。采用方差分析（ANOVA）检验，*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001 表示组间差异具有统计学意义。

图 7 不同纳米疫苗处理后肿瘤组织中免疫细胞的免疫组化分析。（A）肿瘤组织中 CD8⁺浸润细胞与 Foxp3⁺细胞的代表性免疫组化图像。蓝色：细胞核；绿色：CD8⁺区域；红色：Foxp3⁺区域。标尺为 20 μm；（B）肿瘤组织的组织学评估及 TUNEL 凋亡检测。蓝色：细胞核；绿色：TUNEL 阳性（凋亡）区域。标尺为 20 μm。

图 8 纳米疫苗诱导的脾脏免疫应答实验。（A）脾脏中 CD8⁺T 细胞的流式分析及统计数据；（B, C）脾脏中 CD4⁺与 CD8⁺中央记忆 T 细胞（TCM）的代表性流式图及统计数据；（D）脾脏中髓系抑制细胞（MDSCs，CD11b⁺Gr-1⁺）的代表性流式图及统计数据；（E）脾脏中调节性 T 细胞（Tregs，CD4⁺Foxp3⁺）的代表性流式图及统计数据。采用方差分析（ANOVA）检验，*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001 表示组间差异具有统计学意义。

图 9 纳米疫苗诱导的淋巴结免疫应答实验。（A, B）小鼠淋巴结中 CD8⁺T 细胞与细胞毒性 T 淋巴细胞（CTLs）含量的流式分析及统计数据；（C、D）淋巴结中 CD8⁺与 CD4⁺中央记忆 T 细胞（TCM）的代表性流式图及统计数据。采用方差分析（ANOVA）检验，*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001 表示组间差异具有统计学意义。

论文链接：https://doi.org/10.1016/j.mtbio.2025.101703

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