一、研究背景：糖尿病皮瓣修复的临床困境
据国际糖尿病联盟预测，到2045年全球糖尿病患者人数可能达到7.83亿。在糖尿病的众多并发症中，慢性伤口因其高发病率、有限的治疗选择和高坏死率而成为严重的临床挑战。这些问题源于高血糖诱导的多重病理屏障交织：血管生成受损、过量活性氧（ROS）积累以及持续炎症反应，导致组织修复困难。
皮瓣移植手术作为修复大面积皮肤缺损的重建外科基石，曾被寄予厚望用于修复严重的糖尿病慢性伤口。然而，在糖尿病患者中，皮瓣移植的成功率下降了30%-50%，往往导致二次手术并加重医疗负担。移植皮瓣在糖尿病伤口中存活率低的主要原因在于高血糖微环境下的血管灌注恢复功能障碍，伴随不利的氧化应激和过度炎症。
近年来，细胞外囊泡（EVs）作为“无细胞”治疗平台崭露头角。然而，天然EVs的产量有限，且在体内快速清除，治疗效果大打折扣。如何同时提升EVs的产量和治疗效果，成为丞待解决的关键问题。
二、研究思路：“以毒攻毒”的高明策略
鉴于此，南开大学孔德领教授、王伟伟教授、冯祖建副教授等人与中国医学科学院整形外科医院尹宁北教授团队合作提出了一项巧妙的策略，其核心逻辑可以用“以毒攻毒”来概括：既然高血糖是导致皮瓣坏死的主要障碍，那么用高糖环境来“预训练”内皮细胞，产生的细胞外囊泡是否会自带“抗糖”装备？答案是肯定的。
研究团队设计了GelMA@hEVs微凝胶平台。首先，利用高糖预处理人脐静脉内皮细胞（HUVECs），使其产生的细胞外囊泡（hEVs）在产量和治疗货物上均显著提升。随后，通过微流控技术制备甲基丙烯酰化明胶（GelMA）微凝胶，将hEVs均匀封装其中。这种微凝胶可在缺血部位实现hEVs的持续释放，通过激活HIF-1α/VEGF信号通路，协同发挥促血管生成、抗氧化和免疫调节的多重治疗效果。
Scheme 1. GelMA@hEVs微凝胶用于糖尿病缺血皮瓣再生的整体示意图。高糖（HG）预处理人脐静脉内皮细胞来源细胞外囊泡（hEVs）的制备流程：高糖预处理可稳定人脐静脉内皮细胞内缺氧诱导因子-1α（HIF-1α），提升细胞外囊泡分泌量，并选择性富集HIF-1α、血管内皮生长因子（VEGF）等促血管生成活性货物；甲基丙烯酰化明胶（GelMA）的合成及微流控制备GelMA@hEVs微凝胶：将含GelMA与hEVs的水相通过微流控装置与油相乳化，经紫外光交联形成均一微凝胶；GelMA@hEVs的治疗机制：该微凝胶可在病灶局部缓释hEVs，hEVs激活受体细胞内HIF-1α/VEGF通路，协同发挥多重治疗作用——促进血管生成、清除活性氧（ROS）、调控巨噬细胞由促炎M1型向修复型M2极化，最终提升糖尿病缺血皮瓣存活率、改善组织血流灌注。
三、高糖“预训练”：产量翻三倍的细胞外囊泡
研究团队分别从正常培养和高糖培养的HUVECs中分离细胞外囊泡，通过超速离心法进行纯化后，利用纳米颗粒追踪分析（NTA）、透射电镜（TEM）和蛋白质印迹（WB）进行了全面表征。结果显示，两种囊泡均呈典型的杯状形态，平均直径约130 nm，表面标志物CD9、CD63和TSG101表达均为阳性，说明高糖预处理并未改变EVs的物理性质。
令人惊喜的是，高糖刺激使HUVECs分泌的细胞外囊泡浓度提高了近三倍，蛋白质含量更为丰富。更重要的是，hEVs中HIF-1α和VEGF等关键再生因子的浓度显著高于普通EVs。此外，细胞摄取实验证实，由于同源靶向效应，hEVs在内皮细胞中的摄取效率显著高于普通EVs。
图 1. 细胞外囊泡（EVs）与高糖预处理囊泡（hEVs）的提取及表征。(A) EVs与hEVs的提取流程示意图；(B) 纳米颗粒追踪分析（NTA）检测EVs、hEVs粒径分布；(C) EVs、hEVs透射电镜（TEM）成像；(D) EV标志性蛋白表达水平；(E) EVs、hEVs的Zeta电位；(F) EVs与hEVs颗粒浓度对比；(G) 每10⁵个细胞分泌囊泡数量；(H) EVs与hEVs总蛋白含量对比；(I) 高糖微环境下，人脐静脉内皮细胞分别与Dil荧光标记EVs、hEVs共孵育不同时长后的细胞摄取荧光图；(J) Dil阳性荧光强度定量统计（每组n=3）。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001
四、蛋白质组学揭秘：hEVs的“货物”优势
为了深入揭示hEVs相对于普通EVs的货物差异，研究团队对两种囊泡进行了定量蛋白质组学分析。hEVs拥有一系列独特的差异表达蛋白质，其中165种上调、135种下调。GO功能注释分析显示，hEVs中富集的蛋白质与“血管生成”、“基因表达调控”、“细胞过程”等生物学过程密切相关。
KEGG通路分析进一步表明，这些差异蛋白涉及PI3K-Akt信号通路、HIF-1信号通路、MAPK信号通路和VEGF信号通路——几乎囊括了血管再生和细胞存活的核心调控网络。
五、微流控“造粒”：GelMA微凝胶递送系统
有了优质的hEVs，如何将它们有效递送到伤口部位是下一个关键问题。研究团队采用微流控技术，将GelMA和hEVs的前体溶液作为分散相，液体石蜡作为连续相，通过紫外光交联制备了均匀的球形微凝胶。所获得的GelMA@hEVs微凝胶平均直径约236 μm，形态规整。
微凝胶的降解和释放行为是其治疗效力的关键。体外降解实验显示，GelMA@hEVs在PBS中14天降解约50%，而在胶原酶II溶液中7天即降解超过50%，表现出对缺血微环境的响应性降解特征。在H2O2溶液中120小时累计释放约80%，远高于PBS中的43.67%，体现了环境自适应释放能力。体内活体荧光成像进一步证实，微凝胶将hEVs的体内保留时间从不足24小时延长至72小时以上。
图 3. GelMA@hEVs微凝胶的制备与材料表征。(A) 微流控制备GelMA@hEVs微凝胶流程示意图；(B) GelMA纯微凝胶、GelMA@hEVs微凝胶明场显微镜照片；(C) 两组微凝胶对应的粒径分布直方图；(D) 两种微凝胶扫描电镜（SEM）形貌图；(E) GelMA@hEVs微凝胶能谱（EDS）元素分布成像；(F) 荧光标记后GelMA@hEVs微凝胶荧光成像；(G、H) 两种微凝胶分别置于磷酸盐缓冲液（PBS）、Ⅱ型胶原酶溶液中的体外降解曲线；(I) 微凝胶在PBS、过氧化氢（H₂O₂）环境下hEVs累计释放曲线。数据以平均值±标准差表示（每组n=3）；ns代表无统计学差异
六、体外验证：促进血管生成的“全能选手”
血管新生是皮瓣存活的核心。研究团队从细胞增殖、迁移和管腔形成三个维度全面评估了GelMA@hEVs的体外促血管生成能力。活/死细胞染色和CCK-8实验证实，GelMA@hEVs具有优异的生物相容性，甚至能逆转高糖对内皮细胞的损伤。
在功能评估中，GelMA@hEVs组展现出全面领先的优势：划痕实验中伤口闭合速度最快，Transwell实验中迁移细胞数最多，管腔形成实验中的节点数和总管长几乎是高糖组和GelMA组的两倍。
七、机制揭秘：HIF-1α/VEGF信号轴的核心作用
为了揭示GelMA@hEVs促血管生成的分子机制，研究团队对高糖培养的内皮细胞进行了转录组测序。主成分分析显示，GelMA@hEVs处理组与高糖对照组的基因表达模式存在显著差异。共鉴定出424个差异表达基因，其中186个上调、238个下调。GO富集分析显示，上调基因主要富集于细胞增殖、迁移和生长因子分泌等与血管生成密切相关的过程。
KEGG通路分析中，HIF-1信号通路脱颖而出，Western blot检测证实，GelMA@hEVs处理强效激活了HIF-1α通路，使VEGF表达恢复至接近正常水平。RT-qPCR进一步验证了HIF-1α、VEGF、bFGF和vWF等血管再生相关基因的mRNA表达均显著上调。
最为关键的是，研究团队使用HIF-1α选择性抑制剂KC7F2进行了逆转实验。结果显示，同时使用GelMA@hEVs和KC7F2的组别，血管生成能力显著降低，这一结果直接证实了HIF-1α/VEGF信号通路是介导GelMA@hEVs促血管生成效应的必要途径。
八、一石三鸟：抗氧化、抗炎、免疫调节
糖尿病缺血皮瓣的病理机制不仅限于血管生成障碍。DCFH-DA探针检测显示，GelMA@hEVs组的荧光强度显著降低，证实其能有效清除过量ROS。RT-qPCR检测显示GelMA@hEVs处理显著降低了TNF-α和IL-6的表达，同时升高了Arg-1和IL-10的表达。
免疫荧光和流式细胞术进一步证实，GelMA@hEVs促进了巨噬细胞从促炎的M1表型向促修复的M2表型转化：CD86+细胞比例显著降低，而CD206+细胞比例显著升高。
九、体内验证：皮瓣存活率显著提升
在STZ诱导的2型糖尿病小鼠多穿支缺血皮瓣模型中，GelMA@hEVs组表现出最大面积的存活皮瓣。激光散斑血流成像表明，GelMA@hEVs组展现出最强健的血管再生和血液运输能力。到术后第7天，皮瓣完全闭合，血流灌注量最高，接近正常组织水平。
H&E染色和Masson染色结果显示，GelMA@hEVs组皮瓣组织上皮结构完整、血管组织丰富、胶原纤维排列整齐，皮肤厚度和胶原沉积量均显著优于其他组。
十、体内机制验证：从分子到组织的全面修复
免疫荧光共染色显示，GelMA@hEVs组CD86阳性细胞更少，CD206阳性细胞密度更高。免疫组化染色显示，促炎因子TNF-α阳性率最低，抗炎因子IL-4阳性率最高。CD31和α-SMA免疫荧光染色显示，GelMA@hEVs组的阳性细胞计数均显著高于其他组。
HIF-1α和VEGF的体内表达显示，GelMA@hEVs组中HIF-1α阳性和VEGF阳性的细胞数量最多，血管截面更清晰可见，血管生成更为广泛。这一结果有力地支持了HIF-1α/VEGF通路在介导GelMA@hEVs促血管生成和免疫调节效应中的核心作用。
总结与展望
这项研究针对糖尿病伤口皮瓣存活率低的临床困境，开发了GelMA@hEVs协同平台。核心创新包括两个层面：一是高糖预训练策略，不仅使产量提升近三倍，还选择性富集了HIF-1α、VEGF等促再生因子。二是微凝胶递送系统，通过微流控技术制备的可注射GelMA微凝胶，将体内保留时间延长至72小时以上。
体内外实验一致证实，该平台通过激活HIF-1α/VEGF信号通路，在促进血管生成、减轻氧化应激和调节慢性炎症三个维度协同发力，最终实现了糖尿病缺血皮瓣存活率的显著提升、血管灌注的恢复以及组织结构的再生，且无明显系统性毒性。
论文链接：https://doi.org/10.1186/s12951-026-04776-6
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