导读：

近期，西南医科大学附属中医医院刘宗超教授、汪国友教授、付至江副教授等人开发出一种利用微流控技术制备的载药明胶微球（GM@RES@VAN），旨在治疗因感染导致的难治性骨缺损。这种微球系统通过协同释放万古霉素（VAN）和白藜芦醇（RES），实现了高效杀灭耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）并同步降解生物膜的功能。研究结果表明，该材料能通过调节TNF/HIF-1信号轴来重塑骨免疫微环境，显著降低局部炎症反应并促进新骨再生。在大鼠模型实验中，双药微球组展现出了优异的骨矿物质密度提升与胶原沉积效果。这种结合中西医药物优势的局部递送系统，为修复复杂感染性骨缺损提供了一种极具潜力的临床转化策略。相关研究以“Gelatin macromolecular microspheres constructed by microfluidics regulate the TNF/HIF-1 signaling axis to reshape the bone immune microenvironment and enhance infectious bone defect repair”为题目，发表于期刊《Materials Today Bio》。

本文要点：

1. 研究背景与挑战

• 临床难题： 感染性骨缺损由于细菌生物膜的形成和慢性的炎症反应，临床治疗极具挑战性。

• 传统方案局限： 全身应用抗生素往往难以在病灶达到有效浓度，且存在全身毒性和诱导细菌耐药的风险。

• 解决方案： 开发一种集“抗菌-骨免疫调节”于一体的局部递药系统，实现协同治疗。

2. 微球设计与特性

• 构建技术： 采用微流控技术制备了基于甲基丙烯酰化明胶（GelMA）的复合微球。

• 双药联合：

• 万古霉素（VAN）： 强效杀灭耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA），清除感染障碍。

• 白藜芦醇（RES）： 具有抗炎、抗氧化及促进成骨分化的生物学活性。

• 材料性能： 微球尺寸均匀（约230-250 μm），具有良好的生物相容性，并能实现两种药物的持续释放。

3. 主要研究结果

• 抗菌与生物膜清除： 实验证明微球不仅能杀灭浮游细菌，还能有效降解成熟的MRSA生物膜。

• 骨修复效果： 在大鼠感染性骨缺损模型中，GM@RES@VAN组显著降低了局部细菌负荷和炎症浸润，显著增加了骨密度（BMD）和骨体积分数（BV/TV），促进了新骨形成。

• 细胞保护： 白藜芦醇能保护成骨细胞的线粒体超微结构，减少感染环境带来的氧化损伤。

4. 分子作用机制（TNF/HIF-1轴）

• 核心途径： 研究通过生物信息学及实验验证发现，白藜芦醇主要通过调节 TNF/HIF-1 信号轴来重塑骨免疫微环境。

• 调节作用：

• 下调促炎因子（IL-6、TNF-α、IL-1β）及低氧诱导因子（HIF-1α）的表达。

• 抑制细胞外基质降解酶（MMP9）和炎症酶（PTGS2）。

• 上调成骨标志物（ALP、OCN、COL I）和抗凋亡蛋白（BCL2）。

• 协同效应： 万古霉素作为“先锋”清除感染，为白藜芦醇发挥免疫调节和促成骨作用创造了低炎症的微环境。

5. 结论与意义

该研究成功开发了一种“抗菌-抗炎-促成骨”一体化的治疗策略，通过中西医结合（白藜芦醇+万古霉素）的思路，为治疗难治性感染性骨缺损提供了新的生物材料设计范式。

图 1. 微流控技术制备微球及大鼠局部注射示意图。

GM@RES@VAN 载药微球的合成

本研究利用微流控技术合成了共载白藜芦醇（RES）和万古霉素（VAN）的明胶微球（GM@RES@VAN）：

1. 溶液配制： 将甲基丙烯酰化明胶（GelMA）溶解于 37 ℃ 的 PBS 中，配制成 5%–10% (w/v) 的水相溶液，并加入 0.05%–0.10% (w/v) 的光引发剂 LAP。白藜芦醇首先溶解于少量乙醇中，随后加入水相（控制水相中乙醇的体积分数 ≤ 10%），使其最终浓度达到 1 mg/mL；万古霉素的最终浓度为 5 mg/mL。油相选用液体石蜡（矿物油），并加入 1.0%–1.5% (w/v) 的 Span-80 作为表面活性剂。

2. 液滴生成与固化： 组装同轴玻璃毛细管微流控芯片（内管内径 200 μm，外管内径 500 μm）后，分别以 5 μL/min（分散相）和 20 μL/min（连续相）的流速注入样品，在芯片出口处生成均匀的油包水（W/O）液滴。在出口处或收集瓶中（置于冰浴且避光环境），利用 405 nm LED 灯照射液滴 30–60 秒，完成 GelMA 的光交联固化。

3. 收集与清洗： 向收集的乳液中加入 2–3 倍体积的冷异丙醇（IPA），轻轻翻转混合 30–60 秒，随后在室温下静置或离心（1000–1500 g，3–5 分钟）以去除上清油相；重复此操作 1–2 次，直至上清液基本澄清且无明显油相。依次使用 100% IPA（快速清洗，≤30秒）、70% IPA（一次）、去离子水（一次）和 PBS（三次）清洗微球，直至微球无油味且表面无发泡迹象。

4. 干燥与储存： 将清洗后的微球冷冻干燥（-50 ℃，10 Pa，24 小时）获得干粉，并于 -20 ℃ 下避光保存；使用前用无菌 PBS 重新复水。

5. 药物释放与降解实验： 将 2 mg 载药微球置于透析袋中（截留分子量 3500 Da），浸入含有 2 μg/mL 透明质酸酶的 PBS（pH 7.4）中，在 37 ℃ 下震荡。在设定时间点取样 2 mL 并补充等量新鲜 PBS，通过离心处理后测定上清液中 RES 和 VAN 的浓度，绘制体外释放曲线。降解实验通过记录微球降解前后的干燥重量（W0 和 Wt）来计算其质量损失百分比，计算公式为：降解参与重量比 (%) = (W0 - Wt) / W0 × 100%。

6. 无菌操作： GelMA 和 LAP 溶液通过 0.22 μm 滤膜过滤除菌；白藜芦醇和万古霉素母液同样经 0.22 μm 滤膜过滤。油相则采用高压蒸汽灭菌（121 ℃，20 分钟）。所有操作均在生物安全柜中进行，所有洗涤及收集步骤均确保在无菌环境下完成。

图 2. 微球结构表征及抗菌实验：A. 空白微球与载药微球在 200-100-5 μm 尺度下的形貌表征。B. 空白微球的粒径分布直方图，平均直径集中在 230-250 μm。C. 载药微球的粒径分布直方图，平均直径集中在 230-250 μm。D. 载药微球特征元素碳（C）、氢（H）、氧（O）、氮（N）和磷（P）的分布情况。E. 白藜芦醇的 72 小时药物释放曲线，显示在 48 小时内持续释放约 82.33 ± 2.08%。F. 万古霉素的 72 小时药物释放曲线，在 48 小时内实现了 31.00 ± 1.0% 的持续释放。G. 载药微球的 8 周降解曲线，在第 6 周时降至最低值约 20%。H. 不同组别细菌生物膜 OD590 值的统计分析柱状图，GM@RES@VAN 处理组的 OD590 值显著低于对照组（n = 3, ***p < 0.001）。I. 不同组别活菌比例，GM@RES@VAN 组的细菌存活率显著低于对照组（n = 3, ***p < 0.001）。J. 不同组别细菌计数的柱状图，GM@RES@VAN 组的抑菌率显著高于对照组（n = 3, ***p < 0.001）。K. 不同组别细菌生物膜的照片。L. 不同组别细菌活性染色的照片。M. 不同组别细菌计数的照片。

图 3. 白藜芦醇治疗骨缺损的网络药理学分析：A. 利用 Genecard、ITCM 和 Swiss Target Prediction 筛选参与白藜芦醇治疗骨缺损的 55 种蛋白质。B. 参与白藜芦醇治疗骨缺损蛋白质的相互作用网络图（PPI）。C. 白藜芦醇治疗骨缺损的 20 个核心靶点，主要涉及 IL1B、TNF-α 和 IL6 等炎症因子。D. 20 个核心靶基因的 GO 富集分析和弦图，显示其主要与细胞对脂多糖的反应和肽酪氨酸自磷酸化相关。E. 20 个核心靶基因的 GO 富集分析柱状图。F. 20 个核心靶基因的 KEGG 通路富集分析和弦图。G. 20 个核心靶基因的 KEGG 富集分析柱状图，显示其与细胞凋亡、TNF 和 HIF 信号传导密切相关。

图 4. 白藜芦醇与 9 个核心蛋白的分子对接图：A. 白藜芦醇与 IL1β 的对接结果，结合能 E = −6.2 kcal/mol。B. 白藜芦醇与 TNF-α 的对接结果，结合能 E = −8.1 kcal/mol。C. 白藜芦醇与 IL6 的对接结果，结合能 E = −6.7 kcal/mol。D. 白藜芦醇与 BCL2 的对接结果，结合能 E = −7.2 kcal/mol。E. 白藜芦醇与 HIF1A 的对接结果，结合能 E = −5.9 kcal/mol。F. 白藜芦醇与 JUN 的对接结果，结合能 E = −5.6 kcal/mol。G. 白藜芦醇与 TP53 的对接结果，结合能 E = −5.3 kcal/mol。H. 白藜芦醇与 MMP9 的对接结果，结合能 E = −6.6 kcal/mol。I. 白藜芦醇与 PTGS2 的对接结果，结合能 E = −7.2 kcal/mol。

图 5. 不同组别的组织染色结果：A-D. 与对照组相比，GM@RES 组的炎症有所缓解，炎性细胞比例降至 73.82%；GM@RES@VAN 组的炎性细胞浸润显著减少，降至 19.83%。同时，GM@RES@VAN 组显著低于 GM@RES 组（n = 3, ***p < 0.001）。B-E. 与对照组相比，GM 组缺损区蓝色胶原纤维沉积较少；GM@RES 组胶原纤维沉积相对增加，达到 43.20%；GM@RES@VAN 组缺损区蓝色胶原纤维沉积最丰富，达到 90.60%。同时，GM@RES@VAN 组显著高于 GM@RES 组（n = 3, ***p < 0.001）。C-F. 革兰氏染色显示，与对照组相比，GM@RES 组仍可见少量革兰氏阳性球菌；而在 GM@RES@VAN 组中，视野内仅见散在或几乎无细菌，阳性率降至 8.50%。同时，GM@RES@VAN 组显著低于 GM@RES 组（n = 3, **p < 0.01）。（图例颜色说明详见原文网页版）

图 6. 炎症因子的免疫荧光检测：A-D. 与对照组相比，GM 组、GM@RES 组、GM@RES@VAN 组检测到的 IL1β 均显著下降（n = 3, ***P < 0.001）。同时，GM@RES@VAN 组较 GM@RES 组显著进一步下降（n = 3, **P < 0.01，红色统计线）。B-E. 与对照组相比，GM 组、GM@RES 组和 GM@RES@VAN 组的 TNF-α 均显著下降（n = 3, ***P < 0.001）。同时，GM@RES@VAN 组较 GM@RES 组显著进一步下降（n = 3, **P < 0.01，红色统计线）。C-F. GM 组与对照组之间的 IL6 无显著差异（n = 3, ns）；GM@RES 组（n = 3, **P < 0.01）和 GM@RES@VAN 组（n = 3, ***P < 0.001）均显示显著下降。同时，GM@RES@VAN 组较 GM@RES 组显著下降（n = 3, *P < 0.05，红色统计线）。G. 不同组别 IL1β、TNF-α 和 IL6 表达量的热图。

图 7. 骨组织 CT 扫描及 RNA 检测结果：A. 不同组别骨组织的 CT 矢状面和冠状面结果。B. 与对照组相比，GM@RES 组和 GM@RES@VAN 组的骨体积（BV）显著增加，但 GM@RES@VAN 组与 GM@RES 组相比增加无统计学意义。C. 与对照组相比，GM@RES 组和 GM@RES@VAN 组的骨体积分数（BV/TV）显著增加，但 GM@RES@VAN 组与 GM@RES 组相比增加无统计学意义。D. GM@RES@VAN 组的骨小梁数量（Tb.n）显著增加，但与 GM@RES 组相比无统计学意义。E. GM@RES@VAN 组的骨密度（BMD）显著增加，但与 GM@RES 组相比无统计学意义。F. 与对照组相比，抗凋亡蛋白 BCL2 在 GM@RES 和 GM@RES@VAN 组中表达上调，而 HIF1A、MMP9 和 PTGS2 指标在两组中均显著下降。GM 组所有指标均无统计学差异。G. 与对照组相比，成骨关键蛋白 ALP、OPN、OCN 和 COL I 在 GM@RES 和 GM@RES@VAN 组中显著增加。GM 组所有指标均无统计学差异。ALP、OPN、COL I 在 GM@RES 组和 GM@RES@VAN 组之间存在统计学差异（n = 3, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001）。

图 8. 材料的毒性与生物相容性测试：A. 细胞活性染色用于评估不同载药微球在第 1、3、5 天对细胞存活的影响。B-D. 随着培养时间推移，细胞数量逐渐增加。在第 3 天和第 5 天，GM@RES 组和 GM@RES@VAN 组的细胞数据均高于对照组。E. 使用鬼笔环肽评估不同载药微球对细胞骨架的影响。F. 在鬼笔环肽评估下，GM@RES 组和 GM@RES@VAN 组的细胞数量均高于对照组。G. CCK8 实验检测载药微球在 24 小时和 48 小时内对细胞增殖的影响。在 24 小时内，10 μmol/L 剂量的促增殖效果最佳（n = 3, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001）。

图 9. 促成骨血管生成及机制验证结果：A-C. 不同组别的碱性磷酸酶（ALP）染色及定量分析。与对照组相比，GM@RES 组和 GM@RES@VAN 组的 ALP 染色显著增加，具有统计学意义（n = 3, ***p < 0.001）。B-D. 不同组别的茜素红染色及定量分析。与对照组相比，GM@RES 和 GM@RES@VAN 组的茜素红染色增加显著（n = 3, **p < 0.01, ***p < 0.001）。E-J. 内皮细胞免疫荧光染色显示，GM@RES 组和 GM@RES@VAN 组比对照组有更多的血管形成。F-I. 促成骨指标 RNA 检测。与对照组相比，GM@RES 组的 ALP、COL I、OCN、OPN 的 RNA 表达具有统计学意义。K. 9 个核心蛋白检测的条带图。L. 9 个核心蛋白检测的定量分析及统计。M. 对照组、GM 组与 GM@RES@VAN 组线粒体的透射电镜对比。

图 10. 机制验证与 HIF-1α 抑制实验结果：A. 代表性的 Western blot 条带，展示各组中 HIF1A、IL1B、TNF-α、IL6、BCL2、JUN、p53、MMP9、PTGS2 和 β-actin（内参照）的蛋白表达。B-J. 经 β-actin 归一化后的各指标蛋白密度定量。数据以平均值 ± 标准差表示（n = 3 次独立实验）。除非括号另有说明，NS 表示无显著差异；*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001（与模型组即 Control 组相比）。结果表明，白藜芦醇通过 HIF-1α 依赖性途径发挥抗炎、抗凋亡和基质调节作用，而万古霉素的部分作用不依赖于 HIF-1α；两者的结合产生了协同效应。

图 11. 微流控构建的双药微球通过 TNF/HIF-1 信号通路重塑骨免疫微环境，促进感染性骨缺损修复的分子机制示意图。

论文链接：https://doi.org/10.1016/j.mtbio.2026.103326

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