近期，大连理工大学刘猛教授、李久兴副教授团队开发了一种名为ADC（Aptamer-coupled droplet CRISPR/Cas12a，适体偶联液滴CRISPR/Cas12a）的创新型检测平台，通过结合结构切换适体、液滴微流控技术与CRISPR/Cas12a系统，实现了对癌症生物标志物sPD-L1蛋白的超灵敏检测。研究人员利用微液滴将反应体系分割成数以万计的微小单元，从而大幅提高局部反应物浓度并压制背景噪音，无需传统的核酸扩增步骤即可达到飞摩尔级的检测灵敏度。

该平台能在70分钟内完成自动化定量分析，且在肺癌患者血液样本的临床诊断中表现出极高的准确性。此外，该系统具有模块化优势，仅需更换适体序列即可快速适配多种蛋白质靶点，为癌症早期筛查和传染病诊断提供了一种快速、普适且高效的液体活检方案。相关研究以“Aptamer-Coupled Droplet CRISPR/Cas12a Enables Ultrasensitive sPD-L1 Detection”为题目，发表在期刊《Analytical Chemistry》上。

本文要点：

1. 研发背景与核心挑战

• sPD-L1的重要性：sPD-L1是癌症早期诊断、免疫治疗分层和预后预测的重要液体活检生物标志物。

• 现有技术局限：传统的ELISA灵敏度不足（皮摩尔水平），且操作复杂；PCR方法测量的是核酸而非具有免疫活性的蛋白质。

• CRISPR技术的局限：Cas12a系统虽具有信号放大能力，但通常依赖核酸预扩增来达到高灵敏度，增加了操作复杂性和污染风险。

2. ADC平台的工作原理

• 结构转换适体（ssApt）：设计了一种特殊的适体结构，在没有目标蛋白时，阻断序列（BS）被扣留在适体上；当sPD-L1存在并与适体结合时，会触发构象变化，释放出BS。

• Cas12a激活：释放出的BS作为激活剂，引导Cas12a开启对荧光报告分子的反式切割，产生荧光信号。

• 液滴微流控增强：将反应限制在皮升（picolitre）级液滴中。这种物理限制提升了局部试剂浓度，加速了反应动力学，同时抑制了背景荧光，从而在无需核酸扩增的情况下实现了超灵敏检测。

3. 主要性能指标

• 检测限（LOD）：在缓冲液和复杂血清基质中均可达到 5 pM。

• 检测时间：整个流程（包括液滴生成、孵育和成像）在 70分钟内完成。

• 特异性：能有效区分同源免疫蛋白，选择性超过100倍。

• 诊断准确性：在肺癌患者和健康对照者的盲测血浆样本中，实现了 100% 的诊断准确性，结果与标准ELISA高度一致。

4. 平台优势与应用前景

• 模块化设计：该平台具有通用性。通过更换适体模块，已成功演示了对 SARS-CoV-2 刺突蛋白的灵敏检测。

• 临床潜力：ADC平台无需热循环或复杂的核酸处理，操作简便，适合临床实验室进行快速、超灵敏的液滴活检分析。

• 未来方向：未来可能集成自动化系统、开发基于智能手机的即时检测（POCT）系统，以及扩展到多重蛋白检测面板。

ADC平台（适体偶联液滴CRISPR/Cas12a）主要通过结构转换适体（ssApt）的信号转换与皮升级液滴微流控的物理富集效应相结合，实现了无需核酸扩增的飞摩尔（femtomolar）级超灵敏检测。

具体实现机制分为以下三个关键步骤：

1. 信号转换：从蛋白质到核酸激活剂

由于CRISPR/Cas12a系统本质上是以核酸为中心的，ADC平台设计了一种结构转换适体（ssApt）作为中介。

• 分子开关：适体序列与一个短的阻断序列（BS8）杂化形成双链。在没有目标蛋白时，阻断序列被扣留在适体上。

• 触发释放：当sPD-L1蛋白存在并与适体结合时，适体的构象发生变化，置换并释放出单链的阻断序列。这个释放出来的序列充当了DNA激活剂，引导Cas12a开启反式切割活性。

2. 液滴限制：物理协同增强效应（核心机制）

平台将反应体系分割成约400皮升的单分散微液滴，这种物理限制产生了三个协同效应，将灵敏度提升了约1000倍：

• 大幅提升局部浓度：液滴体积微小，使得试剂（ssApt, Cas12a）和目标蛋白的局部有效浓度比大宗溶液（bulk solution）提升了约3个数量级。这极大地增加了反应物间的碰撞频率，显著加速了反应动力学。

• 极度抑制背景噪声：检测体积从微升降至皮升，使得每个反应单元内的积分背景荧光信号成比例减小。

• 防止信号扩散：液滴间的物理隔离防止了已激活的Cas12a酶或被切割的荧光分子发生扩散混合。非特异性产生的信号被锁定在单个液滴中，不会在整个体系中累积，确保了高信噪比。

3. 数字化定量读数

通过对成千上万个液滴进行自动化荧光成像和阈值处理，平台可以精确区分“阳性”液滴和“阴性”液滴。

• 数字化计数：这种方法将复杂的连续信号转换为了简单的荧光液滴数量（NFD）计数。

• 超低检出限：即使在极低浓度下，只要有一个蛋白触发了一个液滴的荧光，就能被捕捉到。这使得平台在无需传统的PCR或HCR等核酸预扩增步骤的情况下，实现了5 pM的极低检测限。

图1 ssApt偶联液滴CRISPR/Cas12a（ADC）体系用于无扩增超灵敏检测 sPD-L1 的示意图。

图2 ssApt的构建与优化。(a) 适体工作模型：sPD-L1结合后置换阻断序列（BS），并释放激活寡核苷酸。(b) 母体MJ5CL适体及BS1–BS8变体的DNA序列。(c) 在与sPD-L1孵育30 min后，不同MJ5CL/BS8摩尔比条件下ssApt的荧光响应。(d) 阻断序列长度及组成对ssApt性能的影响（30 min检测）。数据表示为3次独立重复实验的平均值 ± 标准差。

图3 MJ5CL/BS8–Cas12a检测的管内验证。(a) MJ5CL/BS8–Cas12a检测体系工作原理：sPD-L1置换BS8，释放的链激活Cas12a/crRNA，并通过FQ-ssDNA的反式切割产生荧光。(b) 切割动力学时间过程曲线。红色：完整反应体系（+Cas12a，+crRNA，+sPD-L1）；灰色：−sPD-L1；蓝色：−Cas12a；绿色：−sPD-L1/−Cas12a。(c) 在不同sPD-L1浓度条件下FQ-ssDNA切割过程中的实时荧光变化曲线。(d) 与50 nM sPD-L1或竞争分析物孵育后的终点荧光信号（1 h）。数据表示为3次独立重复实验的平均值 ± 标准差。

图4 用于无扩增sPD-L1定量的ADC检测。(a) 单分散皮升级液滴的明场显微图；比例尺：200 μm。(b) 存在或不存在1 nM sPD-L1条件下孵育后的荧光图像，以及 (c) 对应的液滴荧光信号，展示了体系的可行性验证结果。(d) ADC检测对递增浓度sPD-L1的响应。(e) 荧光液滴数量（NFD）与sPD-L1浓度之间的关系。(f) 特异性分析：1 nM sPD-L1及竞争蛋白（100 nM）对应的NFD值。数据表示为3次独立重复实验的平均值 ± 标准差。

图5 ADC检测在10% FBS中的检测性能。(a) 10% FBS中检测sPD-L1的荧光响应及 (b) 相应的ADC检测曲线图。(c) 特异性测试：在10% FBS中，1 nM sPD-L1及竞争分析物（100 nM）的NFD值。NFD：荧光液滴数量。数据表示为3次独立重复实验的平均值 ± 标准差。

图6 ADC检测的临床样本验证。(a) ADC平台通过检测血浆中的sPD-L1进行肺癌识别的检测结果。(b) ADC测得的肺癌患者（n = 10）与健康供体（n = 10）血浆中sPD-L1浓度；统计学显著性采用双尾t检验分析（**P < 0.01）。(c) ADC与ELISA对所有受试者sPD-L1水平测定结果的热图比较。数据表示为3次独立重复实验的平均值 ± 标准差。(d) ADC与参考ELISA对20份盲法临床样本检测结果的列联矩阵及性能指标。PPA：阳性预测一致率；NPA：阴性预测一致率。

论文链接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.6c00779

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