文献导读：

近期，辽宁科技大学姜忠良副教授团队发表综述，探讨了液滴微流控技术在组织工程和单细胞分析领域的应用与进展。作者详细对比了各种水凝胶微型化策略，指出传统方法在通量和精确度上的局限，并强调了光聚合技术在实现单细胞封装中的优势。文中重点介绍了聚乙二醇（PEG）及其衍生物，特别是具有良好生物相容性和抗氧抑制特性的PEGNB材料。通过精准控制微通道内的流体动力学，该技术能够克服泊松分布的限制，实现高效的细胞排序与独立包裹。这种自下而上的构建方法不仅有助于揭示细胞异质性，还为再生医学和精准医疗提供了高通量的研究平台。该研究最终旨在通过模拟复杂的三维生物环境，推动功能性人工组织的开发与临床转化。相关研究成果以“Hydrogel Photopolymerization within Microfluidic Droplets for Single Cell Encapsulation”为题目，发表在期刊《Journal of Materials Chemistry B》上。

本文要点：

1. 研究背景与重要性

• 揭示异质性：在单细胞水平研究特定基因表达模式，有助于揭示体细胞群体的异质性，并理解隐藏的调节路径。

• 克服传统限制：传统宏观工具由于尺度差异和效率低下，难以对数百万个单细胞进行快速处理，单细胞封装技术为此提供了挑战与机遇。

2. 水凝胶载体与光聚合优势

• 理想封装载体：水凝胶因其物理化学性质模拟天然组织、具有半渗透性（支持营养/废物交换）及可调的机械强度，成为封装活细胞的理想材料。

• PEG及光聚合优势：聚乙二醇（PEG）具有出色的生物相容性和低免疫原性。相比传统的化学或物理交联，光聚合技术能够在温和条件下实现快速凝胶化，并具备精准的时空控制能力。这使其在进行细胞封装时能保持极高的细胞活性。

3. 微纳制造技术演进

• 从宏观到微观：文章回顾了微井阵列、连续流光刻（CFL）、停止流光刻（SFL）和生物打印等微凝胶制造技术。

• 液滴微流控的胜出：相较于其他技术，液滴微流控（Droplet Microfluidics）能够以极高通量（高达kHz级别）产生高度均一的微型液滴，并实现实时的大小控制。

4. 单细胞封装策略

• 从随机到确定性：

• 被动封装：受泊松分布（Poisson Distribution）限制，单细胞封装效率最高仅为37%，产生大量空液滴。

• 确定性封装：利用惯性聚焦（Inertial Focusing）、螺旋几何形状或自分选技术，可显著提高单细胞封装效率和通量。

5. 面临的挑战：氧抑制与毒性

• PEGDA的局限：常用的PEGDA在微纳尺度聚合时，会受到来自环境（PDMS材料或含氟油）中氧气的强烈干扰，导致氧抑制（Oxygen Inhibition），并产生有害的活性氧（ROS），攻击细胞DNA和蛋白质。

• ROS累积：紫外线暴露时间增长会加剧ROS转化，降低封装细胞的存活率。

6. 新兴材料：PEGNB

• 抗氧性能：聚乙二醇降冰片烯（PEGNB）作为一种新型材料，其硫醇-烯光点击化学对氧气不敏感，能有效减少ROS积累。

• 高细胞活性：PEGNB的聚合过程更加温和且具有高细胞相容性，尤其适用于对环境敏感的细胞类型（如间充质干细胞MSCs）。

7. 主要应用领域

• 组织工程：作为构建功能性3D器官的“自下而上”组装模块。

• 单细胞组学：支持高通量单细胞RNA测序（如Drop-seq、10X Genomics）和蛋白质图谱分析。

• 临床与药物筛选：用于多细胞肿瘤球体构建、药物抗性测试以及细胞治疗（如增强封装MSCs的抗炎活性）。

总结而言，液滴微流控与先进光敏材料（如PEGNB）的结合，成功弥合了细胞异质性研究与复杂组织工程之间的鸿沟，为再生医学和精准医疗提供了强有力的平台。

一张图读懂全文

图1 组织工程支架中使用的材料。a）石墨烯、钛合金和生物陶瓷等材料具有优异的力学性能和生物相容性，因此被广泛用于器官修复和骨组织工程。b）天然水凝胶材料（如壳聚糖、海藻酸盐、透明质酸、胶原和纤维蛋白）由于具有优良的细胞相容性和细胞交互能力，被广泛用于细胞封装。c）合成水凝胶材料（如PVA、PLGA和PLA）虽然具有可调节性能，但可能存在降解产物酸化、毒性以及降解缓慢等问题。d）PEG水凝胶由于具有高含水率、半透性、生物惰性以及可调节性，在组织工程中展现出重要应用潜力。

图2 宏观水凝胶的微型化方法。a）利用PDMS模板制备微孔阵列水凝胶，可实现胚胎干细胞封装与培养。b）连续流光刻（Continuous Flow Lithography, CFL）：在流动微通道中进行显微投影光刻，实现高通量微凝胶制备。c）停流光刻（Stop Flow Lithography, SFL）：在曝光前停止前驱液流动，以提高微结构分辨率与形貌精度。d）生物打印技术：通过空间可控方式构建复杂三维组织结构，并实现多材料、多细胞类型协同打印。e-f）液滴微流控通过T型通道、流动聚焦等方式形成单分散液滴。g-h）通过调节流速比、喷嘴结构及界面张力，可实时控制液滴尺寸与生成稳定性。

图3 液滴微流控构建复杂微凝胶结构及其组织工程应用。a）空心微凝胶可用于保护细胞免受免疫刺激，并促进类器官形成，包括hiPSC来源的人胰岛类器官。b）包裹HepG2细胞与3T3成纤维细胞的核壳结构微凝胶展现出更高细胞活性，体现了“液滴中的器官（organ-in-a-drop）”概念。c）可调形状微凝胶能够用于不同组织工程应用。d）微纤维结构有助于提升胰岛细胞活性与功能。e）具有多个亚腔室的复杂微凝胶可实现多种细胞共培养。f）通过在连续水凝胶中嵌入可降解微凝胶，可形成大孔结构水凝胶，并促进MSC球状体形成。

图4 基于液滴微流控的单细胞封装与分析。a）单细胞被封装进液滴中（箭头所示）。不同细胞浓度下的封装结果符合泊松分布。空心符号表示理论预测值，实心符号表示实验结果。插图为培养装置中的液滴显微图像。b）惯性聚焦与液滴封装结合，可提高含单细胞液滴的生成效率，并实现可控封装。c）螺旋微通道利用Dean力与惯性升力实现细胞有序排列，使细胞排列周期与液滴生成周期匹配，从而提高单细胞占比。比例尺为50 μm。d）液滴中干细胞的显微图像。箭头表示单细胞封装；插图（k=2）显示少量双细胞事件。细胞占据率符合泊松分布。FACS分析可区分含细胞液滴与空液滴。e）单细胞条形码芯片设计：细胞封装、裂解与条形码标记均在芯片内完成。f）用于液滴条形码技术的微流控芯片设计。左图为封装模块，右图为收集模块。箭头分别表示细胞、液滴及流动方向。下方共表达分析图展示了胚胎干细胞中已知及新发现的基因表达关系。g）Drop-seq单细胞mRNA测序文库构建流程示意图：细胞与带条形码引物的微珠分别进入液滴；细胞裂解后释放mRNA，并与微珠上的引物结合；随后液滴破裂、微珠回收，并进行逆转录及PCR扩增。

图5 液滴微流控辅助下的确定性单细胞微凝胶封装。a）单细胞直接封装进微凝胶中，每个液滴中的细胞分布符合泊松统计规律。白色箭头表示含细胞液滴。比例尺为100 μm。b）集成16个液滴生成单元（DMU）的微流控芯片，用于提高单细胞微凝胶产率。单细胞微凝胶产率约为36±1.1%，而空微凝胶比例约为37.3±2.3%。c）PEGNB微凝胶中单细胞封装的微流控芯片设计。采用流动聚焦结构实现乳化；液滴经UV照射后发生光聚合形成微凝胶。通过控制细胞流、PEGNB前驱液及油相的流速比例，可实现稳定单细胞封装。比例尺为100 μm。d）一种基于海藻酸盐水凝胶的被动式单细胞封装方法。细胞首先包覆碳酸钙纳米颗粒，然后形成油包水乳液，仅在存在细胞时发生交联凝胶化，从而实现精准单细胞封装。

论文链接：https://doi.org/10.1039/D6TB00258G

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