间充质干细胞（MSCs）具备自我更新、旁分泌及免疫调节能力，在多种疾病治疗中应用广泛。传统二维单层培养的MSCs（2D-MSCs）易因长期培养出现细胞功能衰退、细胞间通讯受损等问题，而三维培养的MSCs（3D-MSCs）可抑制过度增殖、增强细胞间相互作用，更贴近天然组织特性，在组织再生、伤口愈合等场景中展现出更优治疗效果。即便如此，3D-MSCs的临床应用仍面临现实瓶颈：一方面，其规模化培养过程耗时又费力；另一方面，从供体组织中获取的细胞量往往难以满足治疗需求，即使通过体外扩增补充细胞数量，长期培养仍会导致其多能性丢失，影响治疗效能。因此，亟需开发高效的冷冻保存技术，为3D-MSCs的临床转化提供关键支撑。
近期，昆明理工大学灵长类转化医学研究院司维教授、严亚萍等人开发了一种基于微流控技术的3D-MSCs玻璃化冷冻新方法，通过将人脐带3D-MSCs封装在GelMA水凝胶中制备微球，在降低冷冻保护剂浓度的同时实现96%的高复苏存活率。该方法不仅通过增强线粒体功能和抗氧化能力维持细胞活性，还在小鼠伤口愈合模型中展现出与新鲜3D-MSCs相当的治疗效果，为干细胞疗法的临床转化提供了实用解决方案。相关研究以“Vitrification of 3D-MSCs encapsulated in GelMA hydrogel: Improved cryosurvival, reduced cryoprotectant concentration, and enhanced wound healing”为题目，发表在期刊《International Journal of Biological Macromolecules》上。
本文要点：
1、该研究针对3D培养间充质干细胞（3D-MSCs）缺乏有效冷冻保存技术的问题，开发了一种创新玻璃化冷冻方法。
2、通过微流控技术将人脐带3D-MSCs封装在甲基丙烯酰化明胶（GelMA）水凝胶中，制备成3D-MSCs水凝胶微球（3D-MSCsHM），并优化了冷冻保护剂（CPA）配方。
3、结果显示，该方法仅需30分钟即可完成，使用30%浓度的CPA（15%二甲基亚砜+15%乙二醇）就能实现96%的细胞存活率，较传统方法降低了CPA浓度，减少了细胞毒性。
4、蛋白质组学分析表明，该方法通过增强线粒体功能、提高抗氧化蛋白和生长因子水平，维持了细胞活性与功能。
5、在小鼠背部创伤模型中，解冻后的3D-MSCsHM展现出与新鲜3D-MSCs相当的伤口愈合效果，能促进血管生成和组织修复。
6、该研究成果解决了3D-MSCs在生产后储存、规模化运输及移植前复苏相关的供应链难题，显著提升了3D-MSCs实际应用的可行性。
本研究在技术原理和概念验证上取得了成功，但要转化为可上市的细胞治疗产品，还需跨越以下工程化挑战：
1、微球生产的“一致性”与“无菌性”放大：
挑战：实验室的同轴微流控装置通量有限，且依赖人工操作。放大到临床级别（需处理数十亿细胞）时，如何保证每小时数千甚至数万微球的尺寸、细胞负载量高度均一？同时，如何在开放式液滴生成与光交联过程中维持A级无菌环境？
潜在解决方案：开发一次性、封闭式、并联化的微流控芯片模块，并与无菌流体系统、在线光学检测（实时监控微球尺寸）集成，实现过程分析技术（PAT）控制。
2、冷冻-复温工艺的标准化与自动化：
挑战：文中步骤涉及多次梯度CPA转移、尼龙网蘸取、快速投入液氮等精细手工操作。人工操作的不确定性是临床应用的重大风险。
潜在解决方案：设计全封闭的自动化设备，将微球装载、梯度渗透、快速玻璃化、密封入袋等步骤整合。关键是需要精确控制CPA交换的流体动力学、浸入液氮的速度与角度，以及开发适用于微球批次复温的自动化控温设备。
3、产品质量标准的建立：
挑战：除细胞活率外，对于此类“细胞-材料复合产品”，需建立全新的关键质量属性（CQAs）。例如：微球降解速率是否与体内疗效相关？冷冻后微球的机械性能变化是否需要控制？如何无损检测微球内部细胞的真实状态？
潜在解决方案：结合先进成像技术（如OCT）和非侵入性代谢传感（如植入式生物传感器），建立一套从微球物理属性到细胞功能活性的多维质量控制体系。
图1. MSCs 的分离与表征。（A）人脐带 MSCs 的分离流程，（B）流式细胞术分析 MSCs 表面标志物表达，（C）MSCs 的成脂、成骨及成软骨三向分化能力验证（比例尺：100 μm）
图2. 3D-MSCs 玻璃化冷冻前后细胞活力、功能及形态评估，用于筛选最优冷冻保护剂（CPA）配方与浓度
图3. 水凝胶的合成及理化性质表征。（A）GelMA 材料的合成路线，（B）扫描电子显微镜下材料微观形貌（左图比例尺：100 μm；右图比例尺：500 μm），（C）GelMA 材料固化能力验证实验示意图，（D）凝胶的紫外光固化过程及最终储能模量，（E）GelMA 材料的黏度变化，（F）GelMA 材料的剪切变稀特性，（G）GelMA 材料的溶胀曲线，（H）GelMA 材料的降解曲线（数据以平均值±标准误表示）
图4. 水凝胶微胶囊在低浓度 CPA 条件下对 3D-MSCs 的冷冻保护作用增强
图5. 玻璃化冷冻后 3D-MSCs 及 3D-MSCsHM 的蛋白质组学特征
图6. 小鼠背部创伤模型的治疗效果评估
论文链接：https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2025.139716
(本文仅供参考学习及传递微流控研究成果，版权归原作者所有，如侵犯权益，请联系删除)
