导读：

这篇文章介绍了由洛斯阿拉莫斯国家实验室（Los Alamos National Laboratory）的研究人员开发的一种多相微流控液滴（Multiphasic Microfluidic Droplets, MMDs）平台，旨在解决哺乳动物细胞与细菌共培养中的技术难题。相关研究以“Multiphasic droplet microfluidics platform for controlled bacteria and mammalian cell co-culture”为题目，发表在期刊《Lab on a Chip》上。

本文要点：

1. 核心技术创新

• 多相液滴结构：该平台利用聚合物相分离（基于PEG和葡聚糖的ATPS系统）与光聚合水凝胶技术，生成具有不同隔室的核壳结构液滴。

• 定制化属性：液滴包含支持哺乳动物细胞粘附和生长的水凝胶隔室（由PEG组成），以及支持细菌生长的液体隔室（由葡聚糖组成）。

• 材料稳定性：与易受细菌降解的琼脂糖不同，合成的PEG水凝胶外壳性质稳定，能有效防止细菌泄露或破坏结构。

2. 两种共培养模式

该平台通过架构控制，实现了对宿主-微生物相互作用模式的精确调节：

• 直接共培养（Direct Co-culture）：采用一步生成法，使哺乳动物细胞粘附在液-胶界面上，与核心部分的细菌发生直接物理接触。

• 间接共培养（Indirect Co-culture）：采用两步序列封装法，将哺乳动物细胞完全包裹在水凝胶核心内，使其与外层的细菌物理隔离，仅允许代谢物和信号分子的交换。

3. 生物学应用与优势

• 高通量与可扩展性：该系统支持大规模并行实验，适合筛选人体微生物组中成百上千种细菌对宿主细胞的影响。

• 下游兼容性：生成的液滴尺寸通常小于80 μm，可直接兼容标准的荧光激活细胞分选（FACS）技术进行高通量分析。

• 模拟体内环境：该平台能模拟复杂的生物场景，如肠道粘膜屏障（间接相互作用）或屏障受损后的感染状态（直接相互作用）。

4. 研究结论与局限

• 维持时间：实验证明该系统能稳定维持宿主-微生物共培养超过24小时。

• 尺寸权衡：研究指出液滴大小与细胞活力之间存在权衡。较小的液滴便于分选，但由于营养限制和废物积累，可能影响长期细胞活力；通过增加液滴尺寸（如从50 μm增至90 μm）可提高存活率。

总之，该平台通过精确的物理空间控制和材料工程，为研究复杂的宿主-微生物相互作用提供了一个多功能、高通量的微型化实验室工具。

该微流控平台主要通过对液滴架构（Droplet Architectures）的精确控制，实现了对哺乳动物细胞与细菌之间物理接触的调节，从而同时支持直接和间接两种共培养模式。其核心机制在于结合了聚合物相分离（ATPS）与液滴微流控技术，具体实现方式如下：

1. 间接共培养（Indirect Co-culture）

这种模式模拟了通过物理屏障（如肠道粘膜层）进行的生化通讯。

• 实现方法：采用两步序列封装法（Sequential Encapsulation）。

• 第一步：首先将哺乳动物细胞单独包裹在纯PEG水凝胶微球中（不添加葡聚糖，以消除粘附界面），使其被完全包埋在凝胶内部。

• 第二步：将这些含有细胞的水凝胶微球转移到含有细菌的介质中，再次进行微流控封装，形成新的核壳液滴。

• 空间分布：哺乳动物细胞被完全密封在水凝胶核心内，而细菌分布在外层的液相中。

• 支持机制：水凝胶作为物理屏障防止了哺乳动物细胞与细菌之间的直接接触，但由于其具有一定的孔径（约4–10 nm），允许代谢产物、信号分子和小分子的自由交换。

2. 直接共培养（Direct Co-culture）

这种模式旨在模拟细胞间的物理接触（如肠道屏障受损时的感染状态）。

• 实现方法：采用一步生成法。利用PEG（聚乙二醇）和葡聚糖（Dextran）的液-液相分离特性，在微流控芯片中生成具有液态核（葡聚糖）和水凝胶壳（PEG）的核壳结构液滴。

• 空间分布：细菌被包裹在液态核中，而哺乳动物细胞由于界面能的作用，会自发粘附在液-胶界面（Liquid-gel Interface）上。

• 支持机制：这种布局使得哺乳动物细胞能直接与核心部分的细菌发生物理接触，同时又能依附在水凝胶基质上生长。

关键支撑技术

• 材料稳定性：该平台使用合成的PEG基水凝胶，它比传统的琼脂糖更稳定，能够抵抗细菌酶的降解，确保在超过24小时的共培养过程中维持物理隔绝或界面的完整性。

• 高通量兼容性：无论哪种模式，生成的液滴尺寸通常保持在80 μm以下，这使得它们能与标准的荧光激活细胞分选（FACS）设备兼容，实现大规模的筛选分析。

图1：用于产生单分散多相液滴的微流控平台。(a) PEG 与葡聚糖（Dextran）混合物发生相分离的图像。(b) PEG-DEX 混合物的相图。(c) 用于制造复合核壳结构液滴的微流控装置示意图。(d) 微流控生成的多相液滴（MMD）悬浮液图像。(e) 显示 PEG 和 DEX 分子在多相液滴中分配情况的荧光图像。(f) 明场图像显示了当改变各自通道中 PEG 相和葡聚糖相的相对流速时，多相液滴结构的变化。插图为放大图像。比例尺代表 50 μm。

图2：用于培养贴壁细胞的合成水凝胶系统。(a) 用于制造 PEG 水凝胶的化学反应方案。(b) 测试 PEG 水凝胶渗透性的实验示意图。(c) 荧光分子在 24 小时内渗透进 PEG 水凝胶的明场和荧光图像。(d) 显示不同时间点跨 PEG 水凝胶界面的荧光强度图表。

图3：A549 细胞在 PEG 基水凝胶中的生长情况。(a) 大块凝胶（Bulk gel）细胞生长实验示意图。(b) 在 5% PEG 水凝胶中，单个细胞生长为多细胞球状体的过程。(c) 嵌入不同浓度 PEG 水凝胶中的 A549 细胞随时间演变的实时影像。(d) PEG 水凝胶中细胞聚集体（球状体）的平均直径随时间的变化。误差线代表标准差。所有比例尺均为 50 μm。

图4：在具有水凝胶外壳的多相液滴中共同捕获哺乳动物细胞和细菌。(a) 制造水凝胶多相液滴的实验装置方案。(b) 紫外线（UV）诱导交联后多相液滴的明场图像。(c) 在多相液滴核心封装细菌的方案。(d) 封装在多相液滴核心的 GFP 标记大肠杆菌（E. coli）的明场和荧光图像。(e) GFP 标记的大肠杆菌在多相液滴核心内生长 27 小时的明场和荧光图像。(f) 多相液滴内 4 个时间点的细菌菌落放大荧光图像。白圈突出了多相液滴的核心。(g) 描述分别在多相液滴核心和外壳中共封装细菌和哺乳动物细胞的方案。(h) 在多相液滴中与细菌共封装的单个细胞的明场和荧光图像。(i) 与 (h) 相同，但为多细胞封装。(j) 悬浮在油中的不同直径单室水凝胶液滴中封装细胞的活力统计图。

图5：用于产生哺乳动物细胞与细菌间接共培养反应液滴的两步微流控法。(a) 创建水凝胶多相液滴的两步实验方案。(b) 在水滴中分别封装单个、两个和三个水凝胶颗粒的情况。(c) A549 细胞分别在油中、水中被封装在 PEG 水凝胶中心，以及随后与外壳中的细菌一起被重新封装进完整组装的多相液滴中的明场图像。(d) 使用序列封装法在多相液滴中封装 0 小时和 24 小时后的 A549 细胞及 GFP 标记大肠杆菌的明场和荧光图像。所有比例尺均为 20 μm。

图6：针对不同生物条件的直接和间接共培养方法。(a) 肠道上皮层宿主细胞通过粘膜屏障与肠道微生物群隔开的示意图。这代表了健康肠道的情况，对应于不存在细菌与宿主细胞物理接触的间接共培养实验。(b) 与 (a) 相同，但针对粘膜受损、炎症或疾病的情况，此时细菌和人体细胞可以发生物理及生化相互作用。在这种情况下，直接共培养实验更适合代表宿主-细菌相互作用。

论文链接：https://doi.org/10.1039/D6LC00016A

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