患者来源的肿瘤类器官（PDTOs）是开发个性化治疗方法的极具潜力的3D疾病模型。然而，传统的PDTO制备技术存在诸多局限性，如批次间差异大且通量低。液滴微流控技术（DM）利用微通道生成均一液滴，凭借其高通量与参数可控的优势，在类器官制备领域展现出巨大潜力。但现有大多数液滴微流控装置需极高的初始细胞量（通常为10⁶量级），而活检样本难以获取如此大量的细胞。
近期，加拿大滑铁卢大学研究团队提出了一种“分步式”新策略：先利用微孔板制备出均一的预成型球状体，再通过其设计的双十字液滴微流控芯片，将这些球状体逐个封装入水凝胶微环境中。该方法仅需极低的初始细胞数量（低至6×10⁴个），便能实现单球状体的精准包裹，并在后续培养中保持了球状体超过80%的高活性与优良的均一性。相关研究以“A Versatile Droplet Microfluidic Platform Capable of Confining Preformed Spheroids in Hydrogel Microenvironments for Downstream Growth and Analysis”为题，发表在期刊《ACS Biomaterials Science & Engineering》上。
本文要点：
1、本研究开发了一种液滴微流控平台，用于将预成型肿瘤球体封装到水凝胶微粒中，以解决患者来源肿瘤类器官（PDTOs）构建中初始细胞需求量高、批次差异大等问题。
2、该平台采用双十字形通道芯片设计，利用粘性对比的水凝胶产生流体动力聚焦，可将仅含10^4数量级细胞的预成型球体（直径100-200 μm）高效包裹于明确的水凝胶微环境中。
3、最优条件下，总封装率达75%，单球体封装率为54%。封装后的球体在离线培养5天后仍保持80%以上的存活率，直径变异系数差异小于4%，显示出良好的生物活性和尺寸均一性。该技术为低样本量下的高通量、标准化类器官培养与分析提供了可靠工具。
该平台中“流体动力聚焦”的设计原理在于，利用粘度差异产生的分层流效应，实现对预成型球状体的有序排列与温和封装。具体而言，通过控制双十字形通道芯片中两个分散相（D1和D2）的粘度比（η=μD1/μD2=2-20），使高粘度的D1（含预成型球状体）形成内流，低粘度的D2形成外侧聚焦流，在第一交叉口处将球状体对齐，第二交叉口处被连续相（矿物油）剪切形成单球状体包裹的液滴，避免传统T型芯片的多包裹或空滴问题。
图1 系统操作流程总结：从低细胞量开始形成球状体，随后采用液滴微流控技术将球状体包裹在水凝胶液滴中，并验证其存活率与均一性。
图2 （A）完整的液滴微流控（DM）芯片及尺寸标注，显示装置的入口与出口：入口 1 为连续相（C），即含 3% 体积分数 Span 80 的矿物油（黄色）；入口 2 为分散相 2（D2），即低粘度水凝胶前体（蓝色）；入口 3 为分散相 1（D1），即含球状体的高粘度水凝胶前体（粉色）。出口处为用于收集液滴的 4℃矿物油（绿色）。放大示意图展示了本研究中使用的流体条件，其中流体聚焦宽度（FFW）以粉色标注。（B）DM 芯片在通道连接处的几何结构示意图，标注了通道尺寸与流体流向。
图3 利用 PDMS 微孔板复制品形成均一球状体的流程总结：以低至 6×10⁴个细胞的 L929 细胞悬液为起始材料，将其加入 PDMS 微孔板（PMWs）中并均匀分配至各微孔内。细胞在 4 天内聚集形成均一且致密的球状体。对球状体进行反向过滤处理，得到均一的球状体批次，随后将其加入用于 DM 装置的水凝胶前体中。
图4 （A）不同流体聚焦宽度（FFW）的伪彩色图像，便于区分流体流束：（i）窄宽度（为 WD1 的 20%）、（ii）中等宽度（为 WD1 的 30%）、（iii）宽宽度（为 WD1 的 40%）。球状体数量固定为 5000 个，悬浮于 500μL 5% 质量体积分数 GelMA 中作为分散相 1（D1，粉色），分散相 2（D2）为 2.5% 质量体积分数 GelMA（蓝色）（粘度比 η≈2.5），连续相（黄色）为含 3% 体积分数 Span 80 的矿物油。聚焦宽度通过调整 D1 的压力实现变化。（B）不同 FFW 条件下的包裹效率示意图，对比了液滴中球状体的含量分布。随着 FFW 增大，单球状体包裹的液滴数量增多。（C）在入口储液池中加入不同浓度球状体时装置运行的伪彩色图像：球状体悬浮于 500μL 5% 质量体积分数 GelMA 中，流体条件与（A）一致，FFW 保持中等宽度。（D）不同入口球状体浓度下的包裹效率示意图，对比了液滴中球状体的含量分布。初始球状体数量越多，可被包裹进水凝胶液滴的球状体数量越多；但即使在低球状体数量下，仍能实现有效的包裹。比例尺 = 300μm。
图5 （A）基于水凝胶前体粘度的球状体沉降时间示意图：粘度越高，球状体沉降速度越慢。（B）约 4000 个球状体悬浮于 500μL 2% 质量体积分数海藻酸钠（NaAlg）中：球状体在约 20 分钟后出现明显沉降，每 3 分钟观察一次并记录关键图像。（C）约 4000 个球状体悬浮于 500μL 5% 质量体积分数 GelMA 中：球状体在约 2 分钟后出现明显沉降，每 20 秒观察一次并记录关键图像。（D）入口储液池中加入不同浓度球状体时装置运行的伪彩色图像：球状体悬浮于 500μL 2% 质量体积分数 NaAlg 中作为分散相 1（D1，粉色），分散相 2（D2）为 5% 质量体积分数 GelMA（蓝色）（粘度比 η≈9），FFW 保持中等宽度，连续相（黄色）为含 3% 体积分数 Span 80 的矿物油。比例尺 = 300μm。（E）不同入口球状体浓度（悬浮于 2% 质量体积分数 NaAlg 中）的包裹效率示意图，对比了液滴中球状体的含量分布。
图 6 采用以下液滴微流控流体条件对包裹在水凝胶微粒（HMPs）中的球状体进行分析：分散相 1（D1）为 2% 质量体积分数 NaAlg，分散相 2（D2）为 5% 质量体积分数 GelMA，连续相（C）为含 3% 体积分数 Span 80 的矿物油，在 4℃矿物油出口处收集液滴。（A）包裹后 1 天和 5 天的球状体存活率，数值为四个不同批次的平均值。（B）活/死染色实验图像示例：展示了包裹后 1 天和 5 天的荧光图像（活细胞为绿色，死细胞为红色）及对应的明场图像。比例尺 = 100μm。（C）包裹前 1 天与包裹后 1 天的球状体直径分布，附对应的高斯分布曲线（虚线）。（D）包裹前（Pre-Encap，n=152）、包裹后 1 天（Post Day 1，n=71）和包裹后 5 天（Post Day 5，n=46）的球状体平均直径统计图，红色圆点代表各样本数据。（E）包裹后 1 天含球状体液滴的明场图像，示例液滴中标注了球状体直径的测量方式（黄色轮廓线）。（F）球状体平均圆形度统计图，格式与（D）一致。比例尺 = 200μm。（* 表示 p<0.05，具有统计学显著性）。
图 7 （A）收集并交联后的水凝胶微粒（HMPs）的液滴分布（n=231）。（B）收集后空液滴的明场图像，示例液滴中标注了液滴直径的测量方式（黄色轮廓线）。比例尺 = 200μm。
论文链接：https://doi.org/10.1021/acsbiomaterials.5c01015
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