导读：

该研究介绍了一种基于液滴微流控技术的新型检测方法，旨在识别大肠杆菌中极罕见的异质耐药亚群。研究人员通过将数百至数千个细菌封装在微小液滴中，利用显微镜观察因代谢活动引起的液滴体积收缩，从而精准锁定耐药细胞。与传统检测手段相比，该技术将所需的液滴数量减少了两万倍，且能在24小时内实现自动化检测。通过设计多路复用芯片，该平台能够同时针对多种抗生素进行快速筛查。这一突破性进展为临床诊断败血症等严重感染提供了更高效的工具，有助于预防因耐药亚群被漏检而导致的治疗失败。相关研究以“Droplet microfluidics–based detection of rare antibiotic-resistant subpopulations in Escherichia coli from bloodstream infections”为题目，发表在期刊《Science Advances》上。

本文要点：

1. 研究背景与挑战

• 异质性耐药（Heteroresistance, HR）：指在主流敏感的细菌种群中，存在极少数比例（如 10^-6或 10^-7）的耐药亚群。

• 临床痛点：这种罕见的耐药亚群会导致抗生素治疗失败，但现有的临床标准抗生素敏感性试验（AST）如纸片扩散法、Etests等往往无法检测到它们。

• 现有方法的局限：传统检测 HR 的“金标准” PAP 测试非常耗时耗力，通常需要 2 天以上；而现有的液滴微流控技术通常采用单细胞包裹，检测低频亚群需要数百万个液滴，效率极低。

2. 核心技术方案：液滴微流控检测平台

• 高通量包裹：不同于单细胞包裹，该方法在每个液滴中包裹 100 到 3000 个细菌，并含有生长培养基和抗生素。

• 检测原理（液滴收缩）：

• 如果液滴内含有耐药亚群，细菌会在抗生素存在下生长。

• 生长的代谢活动会引起渗透压变化，导致含有生长细胞的液滴收缩约 10%。

• 这种收缩可以通过显微镜成像和定制的图像处理管道自动识别。

3. 性能优势

• 极高的灵敏度与效率：能够检测到频率低至 10^-6的耐药亚群。

• 液滴需求量剧减：相比于需要 500 万个液滴的单细胞方法，该技术仅需 200 到 300 个液滴即可实现同等灵敏度，液滴需求量减少了 20,000 倍。

• 快速检测：在 12 到 24 小时内即可获得结果，比 PAP 测试快至少一天。

• 低资源消耗：抗生素和培养基的消耗量仅为传统 PAP 测试的 1/5000。

4. 实验验证与多重化设计

• 临床样本验证：研究团队使用从血流感染中分离出的大肠杆菌（ coli）临床分离株进行了验证。

• 抗生素覆盖：针对三类临床常用抗生素：头孢噻肟（CTX）、庆大霉素（GEN）和四环素（TET）进行了测试，结果与 PAP 测试高度一致。

• 多路芯片（Multiplex Chip）：设计了一种多通道微流控芯片，能够同时针对多种抗生素和菌株进行并行检测，提高了分析通量。

5. 临床意义

• 该技术为血流感染（如败血症）中难以发现的异质性耐药提供了快速、自动化的诊断手段。

• 它有助于临床医生及时调整治疗方案，从而降低治疗失败率和患者死亡率。

液滴内细菌生长导致体积缩小的物理机制主要由代谢活动驱动的渗透作用（Osmosis）引起。具体过程如下：

• 代谢驱动的渗透压变化：当液滴中包裹的细菌（如耐药亚群）在抗生素存在下生长时，其代谢活动会改变液滴内部的化学组成，从而产生渗透压变化。

• 液滴间的质量传递：在微流控芯片的孵育室中，含有生长细菌的液滴通常会与不含生长细胞的“惰性”液滴（Inert droplets）接触。由于两者之间存在渗透压差异，驱动了液滴之间的质量传递（Mass transfer）。

• 体积收缩：这种质量传递导致水分或组分从含有生长细菌的液滴中流失到周围的惰性液滴中，从而使其体积缩小。研究观察到，这种收缩通常会导致液滴尺寸减小约 5% 到 10%。

• 环境影响：这种现象的显著程度取决于周围惰性液滴的数量。当只有极少数液滴含有生长细菌时，由于周围有大量的惰性液滴可以支撑质量传递过程，收缩效应最为明显；反之，如果大多数液滴都有细菌生长，尺寸差异则会变得不那么显著。

图1. 技术概览示意图。对于单一抗生素的检测，采用带有一个液滴孵育腔的标准 T 型结液滴发生器（A）；而对于多种抗生素的检测，则使用多个液滴发生器和多个孵育腔组成的多重检测芯片（B）。每个液滴中含有抗生素以及约 400–3000 个被包封的细菌。含有耐药亚群、能够在抗生素存在下继续生长的液滴，其尺寸会缩小约 10%，该变化可通过显微镜检测到（C）。

图2. 在不同 CFU/ml 条件下，MH 肉汤中的 MG1655 会产生不同数量的含菌液滴及生长情况。（A）(i) 10⁴ CFU/ml；(ii) 0 小时时的图像；(iii) 24 小时时的图像及其尺寸。（B）(i) 10⁵ CFU/ml；(ii) 0 小时时的图像；(iii) 24 小时时的图像。（C）(i) 5 × 10⁵ CFU/ml；(ii) 0 小时时的图像；(iii) 24 小时时的图像。黄色边界的液滴表示无细菌生长的液滴，而红色边界的液滴表示出现细菌生长的液滴。

图3. 两种不同抗生素对敏感型 MG1655（10⁵ CFU/ml）的影响。（A）CTX（2 mg/L）。（B）GEN（0.5 mg/L）。针对每种抗生素，MG1655 均进行了三次独立实验［生物学重复（N1、N2 和 N3）］，数据并列展示。

图4. 在抗生素存在下，将敏感型 E. coli 与耐药型 E. coli 混合，以检测耐药性亚群。针对不同实验条件，将标准化后的液滴尺寸随时间变化进行绘图。（A）MG1655 + CTX 耐药株 DA62594，在 CTX（2 mg/L）存在下耐药频率为 10⁻³。CFU/ml = 2.5 × 10⁷。（B）MG1655 + CTX 耐药株 DA62594，在 CTX（2 mg/L）存在下耐药频率为 10⁻⁵。CFU/ml = 5 × 10⁸。（C）MG1655 + CTX 耐药株 DA62594，在 CTX（2 mg/L）存在下耐药频率为 10⁻⁶。CFU/ml = 5 × 10⁸。（D）MG1655 + GEN 耐药株 DA63654，在 GEN（4 mg/L）存在下耐药频率为 10⁻⁵。CFU/ml = 5 × 10⁸。（E）MG1655 + GEN 耐药株 DA63654，在 GEN（4 mg/L）存在下耐药频率为 10⁻⁶。CFU/ml = 5 × 10⁸。（F）MG1655 + TET 耐药株 DA34827，在 TET（5 mg/L）存在下耐药频率为 10⁻⁵。CFU/ml = 5 × 10⁸。（G）MG1655 + TET 耐药株 DA34827，在 TET（5 mg/L）存在下耐药频率为 10⁻⁶。CFU/ml = 5 × 10⁸。

图5. 利用具有异质性耐药（HR）的临床分离 E. coli 检测耐药亚群。单一抗生素检测（A–E）：（A）带有入口与出口的单通道芯片示意图。（B）DA63082 对 CTX 表现出 HR。（C）DA63744 对 CTX 表现出 HR。（D）DA63082 对 GEN 表现出 HR。（E）DA63340 对 GEN 表现出 HR。使用多路芯片同时检测多种抗生素（F–I）：（F）多路芯片示意图，包括对照组、CTX 和 GEN 的入口。（G）DA63333 对 CTX 与 GEN 均不表现 HR。使用多路芯片检测 DA63333，并绘制标准化液滴尺寸随时间变化曲线。只有对照实验出现液滴收缩，而 CTX 与 GEN 液滴中均未观察到液滴收缩及细菌生长。（H）DA63660 对 CTX 表现 HR，而对 GEN 不表现 HR。使用多路芯片检测 DA63660。标准化液滴尺寸随时间变化曲线显示，对照组和 CTX 实验均出现液滴收缩，而 GEN 液滴中未观察到液滴收缩及细菌生长。（I）DA62906 对 GEN 表现 HR，而对 CTX 不表现 HR。使用多路芯片检测 DA62906。标准化液滴尺寸随时间变化曲线显示，对照组和 GEN 实验均出现液滴收缩，而 CTX 液滴中未观察到液滴收缩及细菌生长。每株菌均进行了三次生物学重复实验（N1、N2 和 N3），数据并列展示，表明液滴尺寸缩小是由细菌生长引起的。

论文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adv4558

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