研究背景：

高效的外源物质胞内递送是基因编辑、药物开发及细胞治疗等生物技术领域的核心需求。目前常用的递送手段中，病毒转导存在安全性和高成本问题，脂质体转染受限于细胞类型且具有潜在毒性，而电穿孔则往往会导致不可逆的细胞膜损伤。

近年来，微流控穿孔技术作为一种通过物理挤压产生瞬时膜孔的方法，在提高细胞存活率和递送精确度方面展现出优势。然而，通道堵塞和可扩展性不足仍然是限制该技术大规模应用的主要瓶颈，特别是早期的单通道液滴挤压设计，极易受细胞团块或杂质影响而导致操作中断。因此，研发一种具备抗堵塞能力且可扩展的高通量平台，对于实现稳定、连续的胞内基因递送具有重要意义。

导读：

近期，韩国高丽大学生物工程系研究人员开发了一项革新性的微流控液滴细胞挤压平台，旨在解决胞内基因传递中常见的通道堵塞与规模受限等难题。该技术通过将细胞封装在微小液滴内，并使其高速通过一系列并联分布的狭窄通道，利用机械形变产生的瞬时纳米孔隙实现物质导入。核心创新点在于引入了旁路通道设计，这能有效平衡内部压力并确保在局部堵塞时系统仍能持续稳定运行。

实验证明，该平台在维持高细胞存活率的同时，实现了极高的传递效率，且具备每小时处理上亿个细胞的卓越吞吐量。这一成果在mRNA转染及CRISPR/Cas9基因编辑领域展现了巨大的应用潜力，为治疗性细胞工程提供了可靠且可扩展的技术方案。相关研究以“Parallelized droplet microfluidic mechanoporation enables robust and clogging-resistant intracellular gene delivery”为题目，发表在期刊《Microsystems & Nanoengineering》上。

本文要点：

1. 核心技术创新

• 抗堵塞并行架构：该平台采用了 4 ×5 的阵列配置，并首次引入了连接相邻挤压通道的旁路通道（Bypass channels）。

• 压力稳定机制：旁路通道的设计能够重新分配流量并稳定内部压力，即使在发生局部堵塞（如细胞团块或杂质）时，也能确保递送过程的持续性和鲁棒性。

• 液滴封装优势：通过将细胞和货物共封装在液滴中，利用液滴内的二次流增强物质运输，同时液滴曲率有助于细胞在挤压后的形态恢复。

2. 关键性能指标

• 高效率与高存活率：对于多种细胞类型，该平台实现了超过 98%的递送效率和 80% 以上的细胞存活率。

• 高吞吐量：标准操作下处理速率为 2 ×10⁷ 细胞/小时，最高可扩展至 1 × 10⁸ 细胞/小时，显著优于先前的单通道设计。

• 低试剂消耗：由于在微小液滴和油相环境下操作，该方法降低了所需货物和培养基的质量。

3. 应用验证

• 货物多样性：成功递送了不同分子量的 FITC-右旋糖酐（3 kDa 至 2000 kDa）、mRNA 以及 CRISPR/Cas9 核糖核蛋白（RNP）复合物。

• 细胞普适性：在 K562、THP-1、Jurkat、HEK293T 和 CHO 等多种悬浮及贴壁细胞系中均表现良好。

• 功能性基因编辑：实现了高效的 mRNA 转染（约 98%）以及针对 Jurkat 细胞的 CRISPR/Cas9 介导 CD3 敲除（效率超过 99%）。

4. 结论与意义

该平台克服了微流控穿孔技术中通道堵塞和可扩展性不足的主要瓶颈。这种可扩展且可靠的策略为细胞工程、治疗开发以及单细胞分析提供了一种实用的解决方案。

并行化液滴微流控机械穿孔技术的核心原理是什么？

一、核心递送原理（细胞层面）

1、液滴包裹

细胞与外源货物（mRNA、DNA、蛋白、CRISPRCas9 RNP 等）在微流控通道内被油相包裹成独立离散液滴，每个液滴相当于一个微型反应单元。

2、高速挤压变形

液滴被鞘流加速，强行通过比细胞直径更窄的微通道收缩区，细胞被快速压扁、拉伸，发生剧烈机械形变。

3、瞬时膜穿孔

机械形变让细胞膜产生可逆纳米级小孔，不破坏细胞整体结构，开孔仅维持极短时间。

4、对流式货物进入

细胞退出收缩区后快速回弹，细胞膜内外形成对流压差，货物直接通过纳米孔进入胞内；同时液滴内部的二次流进一步推动货物扩散，提升递送效率。

二、并行化与抗堵塞原理（设备层面）

1、并行阵列扩容

采用4×5 阵列：4 行并行通道，每行 5 个串联收缩单元，把单通道处理能力成倍放大，实现高通量（2×10⁷ 细胞/小时）。

2、旁路通道稳流抗堵

相邻收缩单元之间用垂直旁路通道连通：

• 正常时：均衡压力，提升形变与递送效率

• 堵塞时：流体自动分流，不中断运行、不爆管、不停机从根本解决传统微流控最常见的通道堵塞失效问题。

一句话极简总结

液滴包裹保护细胞，机械挤压瞬时开孔，并行阵列提升通量，旁路通道防止堵塞，最终实现高效、高活、高通量、抗堵的无载体胞内递送。

图1：液滴-细胞挤压阵列平台的设计与工作流程。a 液滴挤压阵列微流控设备的示意图。b 基于对流的货物运输机制图解，突出了关键阶段：(1) 细胞封装、(2) 变形、(3) 递送及 (4) 恢复。蓝色箭头表示平行的垂直旁路通道。c PDMS 通道的高速明场图像，黑色箭头指示被包裹在液滴内的细胞。d 包含封装细胞的液滴明场图像。e 明场和荧光图像显示了 K562 细胞在通过胞吞作用（对照组）和液滴挤压递送 3–5 kDa FITC-右旋糖酐后的情况，成像于处理后 18 小时（比例尺：100 µm）。

图2：递送特性分析：通道几何形状、流速的影响及细胞变形评估。a 影响液滴挤压设备递送效率和细胞存活率的参数。在不同加速油鞘流流速下，针对各种通道参数显示的 (1) 递送效率、(2) MFI 倍数变化和 (3) 细胞存活率图表：b 挤压处数量、c 挤压处长度及 d 挤压处宽度。e 高速相机图像显示：(1) 液滴产生和细胞封装，以及 (2) 水相中的细胞（比例尺：200 µm）。f 细胞挤压 (CS) 和液滴挤压 (DS) 的 (1) 递送效率、(2) MFI 倍数变化和 (3) 细胞存活率图表。误差棒表示平均值 ± 标准差 (N=3)。g 高速相机图像显示的参数 P、a 和 p：(1) P 表示压缩前的周长（红圈）；(2) a 和 p 分别表示压缩过程中的表面积和周长，均由蓝色边界标出。h 高速相机图像显示不同鞘流流速下的细胞变形情况。i 变形后与变形前的细胞前表面积比值 (S₂/S₁)。误差棒表示最大值和最小值 (N=30)。比例尺代表 20 µm。*** 表示 P 值低于 0.001。

图3：旁路通道和液滴存在对胞内递送的影响。在堵塞和非堵塞条件下，比较有无旁路通道的芯片功能的 (1) MFI 倍数变化、b 递送效率和 c 细胞存活率图表。BP：带旁路通道的芯片；NBP：不带旁路通道的芯片；CBP：堵塞条件下的带旁路通道芯片；CNBP：堵塞条件下的不带旁路通道芯片。所有误差棒均表示平均值 ± 标准差 (STD) (N=3)。d 高速相机图像显示细胞被挤压前后的变形情况：(1)-(2) 无旁路通道和 (3)-(4) 有旁路通道（比例尺 = 20 µm）。e 变形后与变形前的细胞前表面积比值 (S₂/S₁) 曲线图，以及 f 挤压瞬间的细胞高度。误差棒代表数据的最大值和最小值 (N=30)。N.S. 表示无显著差异。*、** 和 *** 分别表示 P 值低于 0.05、0.01 和 0.001。

图4：递送特性：货物尺寸、货物浓度、细胞类型和细胞密度。a–c 不同尺寸 FITC-右旋糖酐的递送效率、平均荧光强度 (MFI) 倍数变化及荧光强度直方图。d–f 不同浓度 FITC-右旋糖酐的递送效率、MFI 倍数变化及荧光强度直方图。g 2000 kDa FITC-右旋糖酐在不同细胞系中的递送效率及 h 相应的细胞存活率。针对 2 × 10⁷ 和 1 × 10⁸ cells/mL 细胞密度的 (i) 递送效率、j MFI 倍数变化、k 细胞存活率和 l 荧光强度直方图。误差棒表示平均值 ± 标准差 (STD) (N=3)。A.U.：任意单位。N.S. 表示无显著差异。*** 表示 P 值低于 0.001。

图5：通过液滴-细胞挤压、脂质体转染和电穿孔将 EGFP-mRNA 递送至 K562 细胞。a 明场和荧光图像插图，展示了 24 小时后通过胞吞作用和液滴-细胞挤压实现的 mRNA 表达情况。

在不同 mRNA 浓度下，mRNA 表达的 (b) 递送效率、c MFI 倍数变化和 d 荧光强度直方图。

e 明场和荧光图像插图，展示了 24 小时后通过脂质体转染 (LP)、电穿孔 (EP) 和液滴挤压 (DS) 实现的 mRNA 表达情况。液滴挤压、电穿孔和脂质体转染的 (f) 递送效率、g MFI 倍数变化、h MFI 倍数变化 × 存活率，以及 i 荧光强度直方图。比例尺代表 100 µm。所有误差棒均表示平均值 ± 标准差 (STD) (N=3)。N.S. 表示无显著差异，*** 表示 P 值低于 0.001。

论文链接：https://doi.org/10.1038/s41378-026-01273-6

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